Western Blot技術服務，WB免疫印跡，WB實驗代測

更新時間：2015-10-16

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Western Blot技術服務，WB免疫印跡，WB實驗代測
免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA 結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

Western blot 檢測	1200元/膜	每張膜1--8樣本，含實驗室現(xiàn)有一抗
EMSA	2800元/膜	每張膜1--8樣本，包括探針及試劑

備注：具體價格請客服！

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Western Blot實驗
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成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：

凝膠洗脫：轉移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析

吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析

處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測

成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：

陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率

陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性

二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性

內(nèi)參對照：檢測標本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果

WB 檢測基本過程

1 、獲取細胞或組織裂解物

1）根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

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蛋白位置	推薦buffer
全細胞	NP-40 or RIPA
胞漿（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞漿（骨架結合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取試劑盒
線粒體蛋白	RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質(zhì)量

2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質(zhì)

根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：

待測蛋白狀態(tài)	凝膠條件	上樣buffer	電泳buffer
Reduced - Denatured	還原，變性	含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced - Native	還原，不變性	含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不還原，變性	不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不還原，不變性	不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量（kDa）	凝膠濃度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4 、轉膜

根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率。各種膜的技術參數(shù)及比較如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龍膜
靈敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	較高
蛋白結合能力	100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
機械強度	強	干的膜易脆	軟而結實
溶劑抗性	強	差	差
使用前是否需要浸潤	100%甲醛潤濕	緩沖液潤濕	緩沖液潤濕
適用染色方法	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁	不能用陰離子染料
適用檢測方法	顯色法、化學發(fā)光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測	顯色法、化學發(fā)光、熒光、放射性	顯色、化學發(fā)光、放射性
適用范圍	普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析、重復檢測	普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白	低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用
價格	高	較低	低

5 、封閉

去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：

選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）

選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）

選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

根據(jù)說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。

抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索一般稀釋度（1:100-1:3000）。

孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標準！

WB常用內(nèi)參及其技術參數(shù)：

內(nèi)參名稱	分子量大小	適用范圍
beta-actin	43kDa	胞漿和全細胞
GAPDH	30-40kDa	胞漿和全細胞
Tubulin	55kDa	胞漿和全細胞
VCDA1/Porin	31kDa	線粒體
COXIV	16kDa	線粒體
TBP	38kDa	細胞核

詳情請參考

7 、二抗孵育

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索一般稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時

8 、底物孵育

選擇顯色或者化學發(fā)光底物。一般傾向于化學發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量

9 、結果分析和檢測

凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片

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