RT-PCR實(shí)驗(yàn)代測之RT-qPCR原理！

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實(shí)時RT-PCR定量測定mRNA實(shí)時RT-PCR應(yīng)用于明確要求定量數(shù)據(jù)分析的分子醫(yī)學(xué)、生物工程、微生物學(xué)和診斷學(xué)定量測定mRNA所用的的方法。盡管他被描述成“黃金”標(biāo)準(zhǔn)，但他還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到成為標(biāo)準(zhǔn)檢測的程度。由RNA模板的多變性、含量測定的設(shè)計和方案造成的很重要的問題，與不恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析一樣，也是被眾人所知卻又忽視掉了。標(biāo)準(zhǔn)化的*步，我們描繪了一系列RT-qPCR草案的基本的技術(shù)步驟，要求產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可靠性和重演性。我們更愿意強(qiáng)調(diào)說，無論如何，RT-qPCR數(shù)據(jù)只是關(guān)于一個細(xì)胞或組織給定轉(zhuǎn)錄物的量的快速測定的信息。任何可變的mRNA水平的生物結(jié)果分析必須包括關(guān)于調(diào)節(jié)RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。

這里描述的整個試驗(yàn)，包含了zui初的含量設(shè)計到qPCR數(shù)據(jù)分析，需要大約15小時。INTRODUCTIONRT-QPCR包括三部分：

①依靠逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA;

②用pcr擴(kuò)增cDNA;

③實(shí)時監(jiān)測和定量測定cDNA的量盡管已經(jīng)選用為定量測定RNA的方法，

這種含量測定的安全性依然值得商榷。首要的是以下幾點(diǎn)：

①結(jié)果依賴于模板的量、質(zhì)量和佳的方案設(shè)計;

②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)不是標(biāo)準(zhǔn)化的，因此，可能多變性高;

③數(shù)據(jù)分析高度主觀化，如果操作不恰當(dāng)含量測定的結(jié)果就會混亂。因此，通過質(zhì)量評估每一個RT-qPCR組分含量和保持?jǐn)?shù)據(jù)分析的統(tǒng)一性來降低多變性和擴(kuò)大重現(xiàn)性是必要的。基因表達(dá)測定標(biāo)準(zhǔn)化明確要求，與人類臨床診斷分析有顯而易見的關(guān)系。

因此，我們關(guān)注這個實(shí)驗(yàn)的遍及整個實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的質(zhì)量控制。

THE ASSAYRT-PCR (qPCR)在單管PCR的擴(kuò)增和測定步驟結(jié)合使用熒光指示染料。含量的測定依賴于測定增加的熒光信號，其強(qiáng)度與每一次PCR循環(huán)的產(chǎn)物量成正比。

此外，在單次反應(yīng)中，用不同染料標(biāo)記的探針能夠監(jiān)測和定量多標(biāo)記的目的基因。在一次循環(huán)中，單次PCR熒光*次超過既定的或背景熒光閾值，這個參數(shù)就稱為循環(huán)閾值(Ct)或交叉點(diǎn)(Cp).起始濃度越高，Ct值越小。

當(dāng)維持PCR分析滴定終點(diǎn)敏感性和特異性時，這種熒光和擴(kuò)增物的相關(guān)性使目的基因能夠在一個較大的范圍內(nèi)被定量。閉管(均質(zhì))形式消除了擴(kuò)增后手工操作的需要，顯著的減少了手工操作的時間和污染的風(fēng)險。Current problems這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用造成大量的可定量測定數(shù)據(jù)的方法的產(chǎn)生，利用

①新鮮的、冷凍的或FFPE樣品;

②整體活組織檢查、顯微切割、單個細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞;

③總RNA或mRNA;

④一系列不同cDNA引發(fā)機(jī)制;

⑤不同的酶或酶切反應(yīng)體系;

⑥不同效率、靈敏度和活躍的檢測

⑦多樣的檢測試劑、反應(yīng)條件、熱循環(huán)儀

⑧個人的分析方式及報告方法。每一步都明顯不具有標(biāo)準(zhǔn)化的檢測，在樣品處理、對照的使用、數(shù)據(jù)處理和質(zhì)量控制處理的不同使這種不標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)一步加劇，并且與RT-qPCR的可靠性、相關(guān)性和重復(fù)性有及其密切的關(guān)系。

理想的情況是，在每一步引入不確定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計時，要通過比較所有可能的實(shí)驗(yàn)方案得出。顯然這種方法的并不現(xiàn)實(shí)，我們提出一系列基于現(xiàn)在的一些想法試驗(yàn)方案，每一步都包含在內(nèi)。逐一討論樣品的選擇、儲存和RNA的提取已經(jīng)超出了本文的范圍，我們將在別處予以介紹。本文從RNA的提取開始。我們相信這些試驗(yàn)方案將為大多數(shù)研究人員所接受并且能夠產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。在每次試驗(yàn)中，每一個推薦的特定的試驗(yàn)方案的都會經(jīng)過驗(yàn)證，但是不同的應(yīng)用可能需要許多修改以適應(yīng)特定的使用者。

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