產(chǎn)品分類
Products1)噬菌體DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是zui常用的表達菌株,噬菌體DE3是λ噬菌體的衍生株,構建好的表達載體可以直接轉入表達菌株中,誘導蛋白的表達方式與lac啟動子一樣都是iptg誘導。
2)表達菌株BL21(DE3)上帶有l(wèi)acI基因,T7 RNA 聚合酶編碼基因以及l(fā)acUV5啟動子,lacUV5啟動子可以啟動T7 RNA 聚合酶的表達;
3)表達質(zhì)粒如pET-28質(zhì)粒帶有T7啟動子和編碼阻遏蛋白lacI的基因,在插入目的基因后,lacI是失活的;
4)在非誘導條件下,表達菌株中表達出的lacI阻遏蛋白可以作用于T7 RNA 聚合酶前的lacUV5啟動子,從而抑制T7 RNA 聚合酶的表達。IPTG是乳糖類似物,可以與阻遏蛋白lacI結合,使其對lacUV5啟動子失去阻遏作用,T7 RNA 聚合酶得以合成,繼而與pET-28質(zhì)粒上的T7啟動子結合,啟動下游基因包括目的基因的表達,從而產(chǎn)生目的蛋白。
需要注意的是:
由于T7 RNA 聚合酶的調(diào)控方式仍可能有痕量的本底表達,控制基礎表達的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖,有助于控制本底表達水平。
二是采用帶有T7 lac啟動子的載體——這些質(zhì)粒在緊鄰T7啟動子的下游有一個lac操縱子序列。它們同樣帶有常規(guī)啟動子以及編碼lacI阻遏蛋白的序列,T7lac和 lacI啟動子位置交錯。采用這種載體及DE3溶原菌,lac阻遏蛋白既可以作用于宿主染色體lacUV5 啟動子,抑制宿主聚合酶轉錄T7 RNA聚合酶,也可以作用于載體T7lac 啟動子,從而阻斷任何 T7 RNA聚合酶導致的目的基因轉錄。普通 T7 啟動子和 T7 lac 啟動子的區(qū)別在于蛋白表達的嚴緊性不同。T7 lac啟動子在啟動子區(qū)下游 17bp 處含有一個 25bp 的 lac 操縱序列,屬于高嚴緊性的啟動子。該位點結合lac阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA 聚合酶的轉錄。而普通的 T7 啟動子表達量更高些。
如果這還不夠,更為嚴謹調(diào)控手段還有在宿主菌中表達另一個可以結合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶,降低本底表達。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE,相容的ori都不會影響后繼的表達質(zhì)粒轉化,前者表達的溶菌酶的水平要比后者低得多,對細胞生長影響小,而pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平,容易出現(xiàn)過度調(diào)節(jié),增加蛋白表達的滯后時間,從而降低表達水平。
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