重組酶聚合酶擴增（RPA）技術簡介

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應溫度在37°C左右。

RPA原理介紹

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非?？?，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。

RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進行優(yōu)化。

RPA技術有哪些優(yōu)勢

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。

據(jù)介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。