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過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2015/5/5      瀏覽次數(shù):1805

過氧化酶(Catalase,CAT試劑盒說明書

測定意義:

微量法 100 /96 


CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是zui主要的 H2O2 清除酶, 在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理:

H2O2  240nm 下有特征吸收峰,CAT 能夠分解 H2O2,使反應(yīng) 240nm 下的吸光度反 應(yīng)時(shí)間而下降,根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光度計(jì)/酶標(biāo)、臺(tái)式心機(jī)、調(diào)式移液器、微量石比色皿/96 UV 、 研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 30mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 125μL×1 瓶,4℃保存。 

粗酶液提取: 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

收集細(xì)菌細(xì)胞到心管內(nèi),離心棄上; 500 萬細(xì)菌細(xì)胞 1mL 提取液, 超聲波破細(xì)菌或細(xì)(,功率 20%或 200W, 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 ;8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置 冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 240nm,蒸餾水調(diào)零。

2、CAT 檢測工作液的配制:時(shí)在試二中加入 25mL 試劑一,充分混勻,作為作液。

3、測定前將 CAT 檢測工作液在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 工作液,立即混勻并計(jì)時(shí),記錄

240nm 下初始吸光值 A1  1min 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔAA1-A2。

過氧化酶(CatalaseCAT試劑盒說明書CAT 活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿CAT 活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷V ÷T=459×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總)÷T=459×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:


 

單位的定義:每 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/104 cell)[ΔA×V 反總÷ε×d×109500×V ÷V 樣總)÷T =0.917×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εH2O2 摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol /cmd:比 色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反 應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù), 500 萬。

b. 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿CAT 活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷V ÷T=918×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109 V ÷V 樣總)÷T=918×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109500×V ÷V 樣總)÷T=1.836×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεH2O2 摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol /cm;d96 孔板光徑,0.5cmV 樣:加入樣本體積,0.01 mLV 樣總:加入提取液體積,1 mLT 反應(yīng)時(shí)間,1 minW:樣本質(zhì)量,gCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總 數(shù),500 萬。

過氧化酶(Catalase,CAT試劑盒說明書


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