南京信帆生物技術有限公司專注于生命科學和生物醫(yī)學領域，集化學試劑、生物試劑、銷售于一體的生物公司為各大高校，科研單位、醫(yī)院、制藥與診斷試劑生物試劑廠家等客戶提供多種生物學檢測ELISA試劑盒，品質，性能穩(wěn)定，可與ELISA試劑盒開發(fā)行業(yè)內 品質相媲美。
我司的ELISA試劑盒的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應產物易于顯現；能商品化生物試劑。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用zui廣。
1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內不改變,是目前國內ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)中zui常用的一種；（2）聯大茴香胺（OD）,產物為橘黃色，zui大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產物為深棕色，zui大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯甲苯胺（OT）產物為藍色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應快，顏色明顯
酶標抗體標記效果測定：測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
(2) 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果。mol.比值由于結合物中含的IgG并不*可靠，所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時。酶結合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時。
更新時間：2014-01-02 
瀏覽次數：1890
我的位置：